L'image Brainbow est créé en utilisant des combinaisons de protéines fluorescentes pour marquer les neurones dans le cerveau de sorte qu'ils se démarquent lorsqu'on la visionne à l'équipement d'imagerie. Habituellement de trois à quatre couleurs de la protéine fluorescente sont activés dans les neurones, et ceux-ci se combinent pour produire de multiples teintes distinctes totalisant environ 90. Chaque teinte unique provient de la combinaison de différents pourcentages des couleurs de protéines fluorescentes, similaire à la façon dont une télévision crée une gamme de couleurs. Les couleurs de protéines fluorescentes sont généralement de couleur verte, jaune, rouge, et orange ou cyan. Les nuances exprimées par les neurones sont décidées par sélection aléatoire.