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Des échantillons de sang permettent la détection de la cotinine dans le plasma sanguin, si un échantillon de sang exige beaucoup plus de traitement que les échantillons d'urine ou de salive. L'échantillon de sang est d'abord centrifugé pour séparer les cellules sanguines du plasma, des protéines et lourds sont alors précipité. Le tube à essai est centrifugé une seconde fois et ensuite placé dans un évaporateur pour éliminer tout liquide restant;  les protéines sèches, dont la cotinine, sont dissous à l'aide d'alcool méthylique. Une fois de plus, le tube à essai est centrifugé pour séparer des protéines lourdes restantes, et le liquide est décanté et utilisé pour l'analyse. Ce processus est plus long et coûteux que les tests d'urine ou de salive.
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La nicotine est la substance addictive dans les cigarettes et le tabac à chiquer. Mâcher ou l'inhalation de tabac introduit la nicotine dans le corps, où il est métabolisé par le foie et excrété dans l'urine. Le principal métabolite de la nicotine est la cotinine, et cotinine est la principale méthode de détection de la nicotine, car il a une demi-vie jusqu'à 10 fois plus longtemps que la nicotine. En d'autres termes, il est stable dans l'organisme pendant beaucoup plus longtemps. En cas de surdosage soupçonné nicotine, comme quand un enfant mange la gomme de nicotine, la nicotine est mesurée à la place de la cotinine.
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détection de la nicotine en utilisant l'urine est très sensible et permet de détecter même de faibles niveaux de fumée secondaire. C'est la méthode la plus couramment utilisée par les compagnies d'assurance de différencier les fumeurs actifs de fumeurs passifs. Si la détection de la nicotine est par l'urine, la salive ou le sérum sanguin, la différence peut être observée entre les gens qui fument activement trois ou plus de cigarettes par jour et ceux qui ont des niveaux élevés de la fumée secondaire. Les gros fumeurs peuvent également être différenciées des fumeurs légers par la quantité de cotinine dans l'échantillon.
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détection de la nicotine en utilisant des échantillons de cheveux est rare à l'extérieur de tests expérimentaux, car il est coûteux. Cependant, le test de cheveux peut évaluer la consommation de tabac à long terme, car il peut détecter l'exposition à la nicotine jusqu'à 10 jours avant le prélèvement de l'échantillon. Des tests de salive de nicotine sont simples et non invasives;  salive est absorbé par la bouche à l'aide d'un échantillon de tissu ou un tampon, mais il peut être difficile d'obtenir un échantillon suffisamment grand. Enfants ou adultes avec la bouche sèche peuvent pas produire assez de salive pour un échantillon de test. Les tests de salive s'appuient également sur l'exposition à la nicotine très récente et ne parviennent pas à distinguer la lumière des fumeurs actifs de fumeurs passifs.
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Les demandes d'assurance vie ou de la santé comprennent souvent un test de détection de la nicotine. chromatographie liquide à gaz peut détecter la nicotine - ou son métabolite principal, la cotinine - dans l'urine, le sang, la salive et des échantillons de cheveux. La mesure de la cotinine dans l'urine est considérée comme technique de détection la plus sensible à la nicotine. Aucun de ces tests sera parfaitement distinguer entre les fumeurs actifs, les fumeurs passifs ou d'occasion, et les non-fumeurs, à cause des différences individuelles dans le métabolisme de la nicotine sont très variables. Cependant, le test de détection de la nicotine donnera une bonne estimation de l'exposition à la nicotine globale.
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